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通用 RNA 提取试剂盒

产品组分

货号	R1051 （ 50 次）
B体育官网入口网站  RL	60 ml
B体育官网入口网站  RPI	18 ml
B体育官网入口网站  RW	12 ml
DEPC 处理水	10 ml
RNase-free 纯化柱	50 个
RNase-free 离心管	50 个
说明书	1 份

需要自备的B体育官网入口网站

● 氯仿

● 无水乙醇

产品说明

通用 RNA 提取试剂盒是经过改进开发的新一代产品，提高了裂解液的裂解能力和提取的灵敏度，通过在特定适宜的条件下特异、可逆地结合 RNA ，而各种蛋白质和其他杂质均可被去除掉，同时改进的硅基质膜增强了对 RNA 的吸附能力，得到的 RNA 纯度更好，质量更高。该试剂盒可从各种细胞或组织中快速提取总 RNA ，每个吸附柱每次可处理 50–100 mg 组织或 5×10⁶ 细胞，可同时处理大量不同样品，一个小时内即可完成反应。提取的总 RNA 没有 DNA 和蛋白的污染，可用于 Northern blot 、 Dot blot 、 polyA 筛选、体外翻译、 RNase 保护分析和分子克隆等。

保存条件

B体育官网入口网站 RL 应在 2-8℃ 避光保存，其他B体育官网入口网站和纯化柱室温保存。

注意事项 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------
● 初次使用B体育官网入口网站 RPI 和B体育官网入口网站 RW 前，需按比例加入无水乙醇。 18 ml B体育官网入口网站 RPI 中加入 12 ml 无水乙醇（ 3:2 ）， 12 ml B体育官网入口网站 RW 中加入 48 ml 无水乙醇（ 1:4 ）。

● 严防操作环境、使用的容器、耗材和试剂的 RNase 污染。操作过程中勤换手套。

● 使用本产品提取的 RNA 一般不含有 DNA 污染。在极少数情况下（与组织 pH 值等相关），如果有 DNA 污染而又必须去除，则可以用 RNase-free 的 DNase 处理样品。

● 请严格遵照操作步骤操作。

● 不同起始材料的用量及B体育官网入口网站 RL 的用量不同（参见下表），过多或过少的使用量都可能影响 RNA 的质量或产量。若起始材料量很少， RNA 预计产量很低，在异丙醇沉淀时，可加入 20mg/ml 的肝糖原B体育官网入口网站 0.5-1 μl 促进 RNA 沉淀。

样品用量	B体育官网入口网站 RL 的用量
10cm2 的贴壁培养细胞	1 ml
107 的悬浮培养细胞	1-2 ml
100 μl 的白细胞	2 ml
50-100 mg 的普通组织样品	1 ml
50-100 mg 的特殊组织样品（肝、脾、骨及软骨等）	2 ml
15-30 mg 的植物材料（多糖和多酚含量不高的）	1 ml

● 有关 RNA 的吸光度说明如下：

260nm 、 320nm 、 230nm 、 280nm 下的吸光度分别代表核酸、背景（B体育官网入口网站浑浊度）、盐浓度和蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的 RNA 的 R 值应在 1.8-2.0 之间，当 R<1.8 时，B体育官网入口网站中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当 >2.2 时，说明 RNA 已经被水解成单核苷酸。

●  RNA 浓度 = （ OD₂₆₀-OD₃₂₀ ） * 稀释倍数 *0.04 μg/μl 。

操作步骤 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------

第一次使用前应在B体育官网入口网站  RPI 、B体育官网入口网站  RW 中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。

1. 样品处理

●组织：将组织在液氮中磨碎。每 50–100 mg 组织加 1 ml B体育官网入口网站 RL ，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过B体育官网入口网站 RL 体积的十分之一。

●单层培养细胞：直接在培养板中加入B体育官网入口网站 RL 裂解细胞，每 10 cm² 面积加 1 ml B体育官网入口网站 RL 。用取样器抽打几次。

● B体育官网入口网站 RL 的加入量根据培养瓶面积决定，不是由细胞数决定。如果加量不足，可能导致提取的 RNA 中有 DNA 污染。

c. 细胞悬液：离心取细胞，弃上清。每 5–10×10⁶ 动物细胞和植物细胞加入 1 ml B体育官网入口网站 RL 。加B体育官网入口网站 RL 前不要洗涤细胞，以免降解 mRNA 。

2. 将匀浆样品在 15–30℃ 放置 5 min ，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3. 可选步骤： 4℃ 12,000 rpm (~13,400×g) 离心 5 分钟，取上清，转入一个新的无 RNase 的离心管中。

● 如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可加此步骤离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量 DNA ， RNA 存在于上清B体育官网入口网站中。

（如样品含有较多多糖多酚，请增加以下步骤，在上清液中加入 0.2 ×上清液体积的 5 M NaCl 及 1 ×上清液体积的酚 / 氯仿（ 1:1 ），混匀， 12000 rpm 离心 5-10 min ，取上清液加入等体积氯仿，混匀， 12000 rpm 离心 5-10 min ，至第 4 步。）

4. 加入 200 μl 氯仿，盖好管盖，剧烈振荡 15 s ，室温放置 3 min 。

5.  4℃ 12,000 rpm 离心 10 min ，样品会分成三层，从上至下依次是：无色的水相，白色的中间层和黄色的有机相， RNA 主要存在于水相中，水相的体积约为所用B体育官网入口网站 RL 试剂的 60% 。把水相转移到新管中，进行下一步操作。注意不要吸到中间层。

● 第一次使用前应在B体育官网入口网站  RPI 、B体育官网入口网站 RW 中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。

6. 缓慢加入 0.5 倍体积无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到B体育官网入口网站和沉淀一起转入纯化柱中， 4℃ 12,000 rpm 离心 30 s 。 4℃ 12,000 rpm 离心 30 s ，弃掉收集管中的废液。
● 若B体育官网入口网站体积大于纯化柱容积（ 700 μl ），可分两次离心。

7. 向纯化柱中加入 500 μl B体育官网入口网站 RPI （使用前请先检查是否已加入乙醇）， 4℃ 12,000 rpm 离心 30 s ，弃废液。

8. 向纯化柱中加入 500 μl B体育官网入口网站 RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置 2 min ，  4℃ 12,000 rpm 离心 30 s ，弃废液。

9. 向纯化柱中加入 500 μl B体育官网入口网站 RW ，室温静置 2 分钟， 4℃ 12,000 rpm 离心 30 s ，去除残余液体。

10. 将纯化柱放入 2ml 收集管中， 4℃ 12,000 rpm 离心 2 min ，去除残余液体。

● 此步骤的目的是将纯化柱中残余的漂洗液去除，离心后将纯化柱在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的 RT 等实验操作。

11. 将纯化柱转入一个新的离心管中，加 30–100 μl RNase-free ddH₂O ，室温放置 2 min ， 4℃ 12,000 rpm 离心 2 min 。

● 洗脱缓冲液体积不应少于 30 μl ，体积过小影响回收效率。 且 RNA 应保存在 -70℃ （ -80℃ ），以防降解。

● 如果想提高 RNA 得率，可重复上步操作一次，合并两次得到的B体育官网入口网站。